【獲獎?wù)撐摹抗桥c軟組織肉瘤PDX模型的建立及應(yīng)用研究
發(fā)布時間：2017-11-09文章來源：中華骨科雜志, 2017,37(06) : 340-346
作者：孫夢熊 尹飛 孫偉 沈嘉康 馬小軍 傅澤澤 周承豪 王卓瑩 華瑩奇 蔡鄭東
摘要
目的
建立惡性骨與軟組織肉瘤患者來源移植瘤模型（patient-derived xenograft，PDX）模型并統(tǒng)計其建模的成功率，觀察PDX化療反應(yīng)與臨床的符合率，以為篩選敏感二、三線藥物提供理論基礎(chǔ)。
方法
收集自2015年1月至2016年5月共31例骨與軟組織腫瘤患者，男12例，女19例；年齡為9~67歲，平均（28.5±19.9）歲。手術(shù)當(dāng)天取材，取患者手術(shù)中新鮮的活性組織，無菌條件下轉(zhuǎn)移到實驗室后，切至約2 mm3大小，接種于采用穿刺套管針接種于T淋巴細胞缺陷小鼠（BAL B/C裸鼠）或T、B淋巴細胞雙缺小鼠（SCID小鼠）背部皮下，待小鼠背部腫瘤長至1~2 cm直徑時取出腫瘤組織并傳代，同時保存P0組織；若小鼠背部腫瘤3個月無生長則視為建模失敗；分別接種化療前和化療后的病例，比較化療對PDX建模成功率的影響，同時觀察不同病理類型病例的建模成功率，觀察PDX建模成功率與患者預(yù)后的關(guān)系；藥物試驗：將成瘤的PDX小鼠分組，每組3只，不同組給予不同的化療藥物，分別按照化療藥物特性給藥，通過T/C計算抑制率，比較得出PDX模型敏感藥物及不敏感藥物，并與對應(yīng)的患者用藥情況進行比較。
結(jié)果
本組共接種骨與軟組織肉瘤31例，總體建模成功率45.2%。按病理亞型分別為：骨肉瘤24例，建模成功率37%；平滑肌肉瘤2例，成功率100%；軟骨肉瘤2例，成功率50%；尤文肉瘤1例成功；纖維肉瘤1例及滑膜肉瘤1例均未成功?；熀蠼３晒β?3%（4/12），未化療建模成功率53%（10/19）。PDX建模較容易的患者往往提示預(yù)后不佳，PDX模型對化療的敏感性與臨床實際療效具有較好的相符合性。
結(jié)論
骨與軟組織肉瘤的PDX成功率在30%~40%，與腫瘤病理類型、化療有關(guān)，PDX與臨床病例具有較好的相似性，有望用于患者個體化藥物篩選。
骨與軟組織肉瘤是一類起源于間葉組織的惡性腫瘤，有多種不同的病理亞型，如骨肉瘤、軟骨肉瘤、脂肪肉瘤、平滑肌肉瘤、纖維肉瘤等[1]。從基因的角度，骨與軟組織肉瘤可以大體分為兩類：一種是基因組學(xué)復(fù)雜型，即腫瘤細胞中有大量的染色體突變或核型改變；另一種基因組學(xué)相對簡單，往往表現(xiàn)為染色體某一位點突變或染色體轉(zhuǎn)位[2]。盡管骨與軟組織肉瘤只占所有新發(fā)腫瘤的1%，然而其好發(fā)于兒童和青少年，并且會導(dǎo)致19%~21%與腫瘤相關(guān)的死亡，同時病理多樣性及基因組異質(zhì)性使得這類腫瘤往往難以診斷[3]。另外，在某一種類型肉瘤上的研究成果不能完全轉(zhuǎn)化到另一種類型[1]。因此，在該類腫瘤的診療方面，仍需要進行大量有效的研究。骨與軟組織肉瘤目前治療方法除手術(shù)外，為了預(yù)防復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移會輔助以化療,目前臨床應(yīng)用的化療一線藥物主要有甲氨蝶呤、阿霉素、順鉑等，方案較少。近期研究發(fā)現(xiàn)在化療反應(yīng)不佳的骨肉瘤患者中，輔助以異環(huán)磷酰胺和依托泊苷的化療方案增加了化療反應(yīng)的毒性，且并未延長患者的生存期[4]。因此，需要進一步研究行之有效的化療方案。
目前精準醫(yī)療已成為醫(yī)學(xué)特別是腫瘤學(xué)科的熱點，各類關(guān)于腫瘤的精準醫(yī)療的研究正如火如荼地開展中。精準醫(yī)療是根據(jù)患者的某一基因突變進行針對性的靶向治療，其中不乏有一些成功的案例[5]。然而，很多患者并沒有從精準醫(yī)療中獲益，美國MD安德森腫瘤中心篩選了2 600例測序，其結(jié)果顯示只有6.4%的患者適用某種特定基因突變的靶向藥物[6]。造成了一種即使測定到了突變并不等于靶向藥物就一定有效的尷尬局面。而患者來源移植瘤模型（patient-derived xenograft，PDX）是將患者的腫瘤組織接種在免疫缺陷的老鼠體內(nèi)（一般為皮下），讓其在小鼠體內(nèi)成瘤。該模型既保留了患者腫瘤本身分子表型和基因型，保存了腫瘤異質(zhì)性，同時可以利用動物模型對腫瘤的發(fā)病機理及治療進行研究，進一步對患者自身的診療提供依據(jù)。目前，骨與軟組織肉瘤研究領(lǐng)域內(nèi)國內(nèi)未見有類似PDX模型報道。
本研究擬通過建立模型、比較藥物療效及與臨床病例之間的相關(guān)性等方法，以建立惡性骨與軟組織肉瘤PDX模型，目的在于：①統(tǒng)計骨與軟組織肉瘤PDX建模的成功率，觀察并分析病理類型及化療對PDX建模的影響以及PDX建模的成功與否與患者的預(yù)后之間的關(guān)系；②觀察PDX化療反應(yīng)與臨床的符合率。
資料與方法
一、納入與排除標準
納入標準：①臨床病理診斷為骨與軟組織肉瘤；②可獲取活性腫瘤組織者；③同意進行PDX建模并簽署知情同意書者。
排除標準：①無法病理明確診斷的骨與軟組織肉瘤者；②血液系統(tǒng)腫瘤、腎癌、乳腺癌等骨與軟組織轉(zhuǎn)移瘤患者（即非原發(fā)骨腫瘤者）；③患者身體條件不允許進行手術(shù)或穿刺活檢者。
二、一般資料
依上述納入及排除標準，收集自2015年1月至2016年5月共31例于我院行手術(shù)治療的骨與軟組織腫瘤患者的資料，其中男12例，女19例；年齡為9~67歲，平均為（28.5±19.9）歲。
按照病理類型分為：骨肉瘤24例（77.4%，24/31），平滑肌肉瘤2例（6.5%，2/31），軟骨肉瘤2例（6.5%，2/31），尤文肉瘤1例（3.2%，1/31），纖維肉瘤1例（3.2%，1/31），滑膜肉瘤1例（3.2%，1/31）。
按化療與否分：化療后病例12例（38.7%，12/31），未化療病例19例（61.3%，19/31）。
按照腫瘤部位分為：骨盆7例(22.6%，7/31)，股骨14例（45.2%，14/31），脛骨2例（6.5%，2/31），腓骨1例（3.2%，1/31），肱骨5例（16.1%，5/31），頭皮1例（3.2%，1/31），肺1例（3.2%，1/31）。
本研究獲上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院倫理委員會批準，患者簽署知情同意書。
三、建立PDX動物模型
對象為臨床病理確診為骨與軟組織肉瘤的患者，于患者手術(shù)當(dāng)日進行取材。術(shù)中切取活性最高的腫瘤組織（通常為腫瘤包膜下無任何壞死區(qū)域）。
將取得的活性腫瘤組織切成大小約2~4 mm3的10塊，并于無菌條件下4 h內(nèi)使用穿刺套管針接種于BAL B/C裸鼠或SCID小鼠（上海必凱實驗動物中心提供）的背部皮下。接種后每周觀察小鼠腫瘤生長情況，待腫瘤直徑長至1~2 cm時，斷頸處死荷瘤小鼠，無菌條件下切取體內(nèi)腫瘤為2~4 mm3的小塊，分別接種新的小鼠皮下進行傳代，并保存P0組織。
若3個月未見腫瘤生長，則視為建模失敗，本研究中的PDX模型由中美冠科生物技術(shù)（太倉）有限公司建立。
分別按照腫瘤病理類型和是否化療對接種后腫瘤的成瘤率進行統(tǒng)計，并對已成瘤組織切除后行包埋固定，行HE染色，與患者標本的進行對比。
四、PDX動物模型化療藥物實驗
將建模成功的PDX動物模型，傳代穩(wěn)定后接種一定數(shù)量的小鼠（按照需要測試的藥物種類數(shù)量n，接種3n+3只小鼠）。待動物模型的腫瘤大小生長至約100 mm3時，篩選腫瘤大小接近的模型，并分組為對照組和各化療藥物實驗組，每組3只小鼠。
根據(jù)化療藥物的臨床使用指南中的方案，并按化療藥物小鼠/人劑量換算分別定期給予每組小鼠化療藥物，定期測量小鼠腫瘤最長徑和最短徑，計算小鼠腫瘤體積：V=最長徑×最短徑2/2[7]。比較各組腫瘤生長情況，并通過治療組平均腫瘤重量/對照組平均腫瘤重量（T/C）計算抑制率，得出敏感藥物和非敏感藥物。
五、統(tǒng)計學(xué)方法
采用SPSS 22.0（IBM公司，美國）統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計學(xué)分析，計數(shù)資料采用（±s）表示，采用Stundent t檢驗比較PDX模型接種后各組藥物處理組與對照組之間的差異，檢驗水準α值取雙側(cè)0.05
結(jié)果
一、建立PDX模型成功率
本研究中共接種31例PDX模型，其中成功建立動物模型14例，成功率為45.2%（表1）。
各病理類型腫瘤建模的成功率分別為：骨肉瘤9例（37.4%，9/24），平滑肌肉瘤2例（100%，2/2），軟骨肉瘤1例（50%，1/2），尤文肉瘤1例（100%，1/1），纖維肉瘤（0/1）及滑膜肉瘤（0/1）均無建模成功者。
二、PDX模型成功率與化療之間的關(guān)系
未化療PDX建模成功率為53%（10/19），化療后為33%（4/12），較未化療低近20%。
三、PDX建模成功與否與患者的預(yù)后的關(guān)系
建模成功14例中已死亡9例（64.2%，9/14）。能夠建立PDX模型的患者往往預(yù)后不佳，特別是PDX模型建立速度越快者，死亡速度也越快（表1）。如最短成功建模者（41 d），診斷至死亡時間只有26個月；相反，成功建模時間>100 d者，生存時間均較長。因此，PDX建模成功的患者往往預(yù)后不佳，并且建模速度越快，預(yù)后越差。
四、PDX模型接種后藥物處理的作用
（一）原發(fā)骨肉瘤患者PDX模型
本組1例，男，12歲，因右側(cè)膝關(guān)節(jié)疼痛就診，影像學(xué)檢查提示右股骨下段腫瘤，穿刺病理示骨肉瘤。術(shù)前予阿霉素+順鉑，甲氨蝶呤方案化療4次，行腫瘤切除+腫瘤假體置換，術(shù)后病理為右股骨骨肉瘤。術(shù)后給予阿霉素+順鉑，異環(huán)磷酰胺方案化療6周期。
腫瘤切除同時行PDX建模并成功建立PDX動物模型。其中P1~P2腫瘤動物模型的生長曲線表示，PDX模型在P2代時已穩(wěn)定生長。PDX模型切片HE染色與術(shù)后患者腫瘤HE染色的形態(tài)學(xué)基本保持一致。在行術(shù)后化療的同時，使用同樣的化療藥物給PDX模型動物模型行檢測，發(fā)現(xiàn)多西紫杉醇在PDX模型中表現(xiàn)出較好的抑瘤作用，而順鉑在給藥后腫瘤繼續(xù)增大，表現(xiàn)出耐藥性，這與我們臨床治療中患者之后出現(xiàn)的順鉑耐藥結(jié)果一致（圖1）。
圖1 原發(fā)骨肉瘤PDX模型建立及藥物實驗 A，B，C，D 患者PDX模型的建模示意，可見PDX模型在小鼠皮下長出 E，F(xiàn) 患者的病理切片（E）與PDX動物模型病理切片（F）HE染色的對比，細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)基本相同，HE染色×100 G 建模后PDX模型P1~P2代腫瘤生長情況穩(wěn)定 H 利用順鉑和多西紫杉醇単藥處理PDX模型后PDX腫瘤的生長情況，順鉑處理后腫瘤繼續(xù)長大，多西紫杉醇處理后腫瘤縮小
（二）轉(zhuǎn)移性骨肉瘤PDX模型
本組1例，女，11歲，2013年2月因右側(cè)股骨遠端腫瘤行保肢手術(shù)，術(shù)后化療方案為阿霉素+順鉑，甲氨蝶呤。術(shù)后19個月發(fā)現(xiàn)頭頂部約3 cm×4 cm大小腫塊，無紅腫，無壓痛，皮溫正常，穿刺病理證實為骨肉瘤頭皮轉(zhuǎn)移。行吉西他濱+多西紫杉醇化療6次后復(fù)查發(fā)現(xiàn)頭皮下腫瘤幾乎消失，5個月復(fù)查發(fā)現(xiàn)頭皮下腫瘤復(fù)發(fā)，行腫瘤切除，PDX建模，并繼續(xù)行異環(huán)磷酰胺+依托泊苷方案化療6次。
化療期間PDX成功建模，PDX組織學(xué)特性與臨床切除標本組織學(xué)特性相一致，進一步行藥物敏感性篩選，發(fā)現(xiàn)阿帕替尼、安羅替尼、索拉菲尼和多西他賽對PDX模型敏感，但患者未按照建議服藥，致頭皮腫瘤進展死亡（圖2）。
圖2 轉(zhuǎn)移性骨肉瘤PDX模型建立及藥物實驗 A 建模后PDX模型的P0~P1代腫瘤生長情況，到P1代時已生長穩(wěn)定 B，C 患者病理切片與PDX動物模型病理切片HE染色的對比，細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)基本相同，HE染色×100 D 各種不同藥物處理后PDX模型的T/C，其中阿帕替尼、安羅替尼、索拉菲尼和多西他賽對PDX模型敏感，明顯抑制了腫瘤的生長
（三）尤文肉瘤PDX模型
本組1例，男，9歲，因左髂骨腫瘤入院，穿刺病理示左髂骨尤文肉瘤，行長春新堿+放線菌素D+環(huán)磷酰胺，異環(huán)磷酰胺+依托泊苷化療14次，后行手術(shù)切除腫瘤。接種PDX模型并成功建模，PDX組織學(xué)特性與臨床切除標本相一致，術(shù)后四個月腫瘤局部復(fù)發(fā)，PDX模型行藥物敏感實驗篩選結(jié)果提示順鉑和多西紫杉醇化療敏感，但患者未按照建議給藥，致腫瘤進展死亡（圖3，表2）。
圖3 尤文肉瘤PDX模型建立及藥物實驗 A，B，C 患者PDX模型的建模示意圖，可見尤文肉瘤PDX模型在小鼠體內(nèi)建立成功 D，E 患者的病理切片與PDX動物模型病理切片HE染色的對比，PDX模型與患者HE染色細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)基本相同，HE染色×100
討論
一、PDX建模的成功率，病理類型及化療對PDX建模的影響
本研究中，將骨與軟組織肉瘤患者腫瘤接種于裸鼠皮下，總體成瘤率45.2%，其中骨肉瘤37.5%，并發(fā)現(xiàn)骨與軟組織肉瘤PDX模型接種的成功率與病理類型存在一定的相關(guān)性。在其他類型腫瘤中，將肺癌患者的腫瘤組織接種到免疫缺陷的裸鼠皮下，成瘤率24.5%[8]。在高級別肉瘤中，Stebbing等[9]將29例腫瘤接種于裸鼠，22例成瘤，成瘤率76%。另有報道顯示在一組胃癌病例中接種成功率為34.1%（63/185）[10]。成功的建模為進一步個體化治療提供了基礎(chǔ)，也為生物靶點的研究提供了支持，我們建立的PDX模型也將為患者的藥物篩選及進一步的科研提供有效的工具和前提。
化療后骨與軟組織肉瘤PDX模型接種成功率明顯低于未化療時腫瘤接種成功率，某種程度上說明了臨床中所進行的化療對患者的腫瘤具有殺傷作用或有抑制腫瘤活性的作用，同時化療藥物對腫瘤細胞本身的代謝會產(chǎn)生一定的影響，在一些敏感的腫瘤細胞中可以達到殺死腫瘤細胞的效果。從一個側(cè)面也解釋了之前患者化療藥物的有效性。同時，由于化療也會帶來骨與軟組織肉瘤患者的異質(zhì)性，因此在化療后患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)時更加有必要進行PDX建模并重新篩選有效藥物，爭取以最短時間篩選出最有效的化療藥物。
二、PDX建模的成功率與預(yù)后的關(guān)系
PDX建模的快慢提示著患者的預(yù)后的好壞，容易成瘤的PDX模型往往顯示出高度的惡性或侵襲性。這種預(yù)后差的患者建模速度加快及建模易成藥，腫瘤發(fā)展致死亡。能夠建立PDX模型的患者，腫瘤的惡性程度較高，PDX建立速度越快，惡性程度越高。因此，有時候甚至在藥物剛剛篩選出，患者未必來得及按時服藥而死亡，抑或腫瘤的高度異質(zhì)性使得腫瘤細胞發(fā)生了新的突變，影響了藥物的療效。盡管如此，PDX模型對臨床指導(dǎo)用藥特別是靶向藥物具有很實際的意義。
以往骨與軟組織肉瘤動物模型往往以細胞系建立為主，而細胞系的相對單一性，不能更好的代表臨床中多種多樣的腫瘤類型。以患者腫瘤為基礎(chǔ)建立的動物模型可更好的代表腫瘤的生物學(xué)行為，為臨床新藥的研發(fā)提供良好的實驗基礎(chǔ)，在腫瘤異質(zhì)性、耐藥及轉(zhuǎn)移等方面可以提供良好的實驗?zāi)Ｐ?，可以用來作為腫瘤耐藥標志物的篩選。
綜上所述，PDX模型作為骨與軟組織肉瘤的動物模型有以下優(yōu)點：①PDX模型可模擬原腫瘤病灶的生物學(xué)特性；②為患者提供藥敏信息及腫瘤的基因信息；③可提供充足的組織標本來源進行其他研究；④可進一步分離細胞系進行研究。然而，骨與軟組織肉瘤PDX模型仍有不足之處：①建立模型往往耗費時間較長，費用較大，成功率受腫瘤的組織學(xué)類型及化療影響較大；②建立好的PDX模型在患者體外可能會發(fā)生新的變異，同時由于腫瘤間質(zhì)的丟失及微環(huán)境的改變往往會影響腫瘤的生物學(xué)表現(xiàn)；③建立的PDX模型有可能不能發(fā)生轉(zhuǎn)移。
因此，骨與軟組織肉瘤的PDX模型的建立成功率與患者的病理類型及是否化療有關(guān)，并且建立的成功與否與患者的預(yù)后呈一定的關(guān)聯(lián)。PDX模型與臨床腫瘤之間保存了相似的特征。PDX模型可以為骨與軟組織肉瘤患者的個體化藥物篩選提供一定的信息。
